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Annexin V PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒


点击次数:87 发布时间:2019-12-11

 

 

Annexin V PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒

品牌:Solarbio | 货号:CA1030|规格:25T/50T/100T|保存:2-8度避光保存,勿冰冻。

 

英文名称Annexin V PE/7-AAD
别名

细胞凋亡检测试剂盒

产品简介:
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性,对 PS 有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用 AnnexinV 与7-AAD 双染的方法,通过流式检测细胞早期凋亡。

 

操作步骤:

1、细胞样品的准备: a)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻 用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。再次 收集到离心管内。1000rpm 左右离心 5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心管底, 可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约 50µl 左右的培养液,以避免吸走细胞。加入约 1ml 4℃预冷的 PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清; b)对于悬浮细胞:1000rpm 左右离心 5min,沉淀细胞。对于特定的细胞,如果细胞无法完全离心至离心 管底,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清,可以残留约 50µl 左右的培养液,以避免 吸走细胞。加入约 1ml 4℃ 预冷的 PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清;

2、用去离子水按 1:3 稀释结合缓冲液(4ml 4x 结合缓冲液+12ml 去离子水);

3、用 1x 结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为 1-5×106 /ml;

4、取 100µl 的细胞悬液于 5ml 流式管中,加入 5µlAnnexin V/PE 混匀后于室温避光孵育 5 分钟;

5、加入 10µl 20ug/ml 的 7AAD,并加 400µl PBS,立刻进行流式检测。

 

实验设计:

1)未转染细胞 空白管:阴性对照组细胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于调节电压; 单染管:阳性对照组细胞,只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于调节补偿; 检测管:处理的细胞,加 Annexin V/PE,7AAD。用空白管和单染管调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。

2)转染 GFP 未转染空白管:未转染细胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于调节电压; 未转染单染管:未转染且有明显凋亡的细胞,只加 Annexin V/PE 或只加 7AAD。用于调节补偿; 转染 GFP 空白管:转染 GFP 对照组细胞,不加 Annexin V/PE,7AAD。用于调节补偿 检测管:处理的细胞,加 Annexin V/PE,7AAD。调节好电压补偿后,获得所需要的流式数据。

 

注意事项:

1、Annexin V 是与磷脂酰丝氨酸(PS)亲和,而 PS 在不同种属间没差异。在正常细胞中,PS 只分布在细胞膜脂 质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,PS 由脂膜内侧翻向外侧;

2、低浓度胰酶消化,轻柔吹打贴壁细胞 2~3 次,离心机 4℃1000rpm 5min 离心,处理得当的话,胰酶造成损 伤可以控制在 5%以内,有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。

3、先加PI 不仅染色是否每组都均匀充分很难判断,而且 PI 本身对细胞也是有毒性的,对实验结果影响会比胰 酶大,不建议这样做;

4、Annexin V 是Ca 依赖的蛋白,所以不能加入 EDTA,防止 EDTA 螯合了 Ca 离子从而影响 Annexin V,进而影 响结果。

5、用流式检测凋亡时,PI 受时间的影响很大,因标记了 PI 后会加大细胞毒性,随着时间延长会导致 PI 的染 色增加,特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外,误差会明显 加大。一般 PI 加上后立刻上机,然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以,但是按照我们操作步骤造成 的误差会更小。

 

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