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FITC荧光标记抗标记体难吗?四个技巧轻松解决

发布日期: 2020-11-04
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  免疫学实验中,经常需要将抗体标记上酶或者荧光素,大部分科研工作者一提到FITC荧光标记抗体往往会很畏惧,主要原因是不知道如何下手,参照一些文献的方法和步骤做出来的结果往往不尽如人意,往往让实验人员畏而束手。其实,抗体的标记确实有一些麻烦和一些小技巧,但不是太神秘的事情。
  
  一、你需要了解你现在所需要的标记物的特性,选择合适的带活性标记物(HRP酶,生物素或者荧光染料),对活性的标记物要清楚其溶解性(脂溶性还是水溶性)、保存要求、活性位点化学反应特性等等。
  
  有些荧光染料有较为苛刻的要求,一定要防潮,一旦遇到水活性键在几分钟内或几小时内完全失活。在保存FITC荧光标记抗体时都要求避光,使用和反应过程都要尽量避光。活性染料的活性键与抗体的反应基团必须要清楚,这样才能保证给其提供适宜的反应条件。
  
  二、FITC荧光标记抗体的纯度要好,特异性和溶解性也要好,尽量不要有变性抗体和沉淀物。其溶解的溶液环境以无机盐(比如PBS环境)为佳,处于一个合适稳定的PH值环境,溶液中不含有游离的可干扰反应的物质,比如,大部分的活性染料是与抗体的伯氨基(-NH2)反应,所以溶液中一定不能含有带伯氨基的化学物质(比如游离的氨基酸,游离肽之类的)。
  
  我们纯化抗体过程需要大量使用这些试剂,在后期往往没有去除干净。加个标准参照,一些非活性的染料都可以作为参照指示剂,实在找不到合适的染料,加点蓝墨水也可以,一般来说如果可以准确计算,颜料的摩尔数是预除去小分子的20倍为宜,透析或者超滤到看不到颜色,这个基本上可以保证您对游离小分子去除干净。
  
  三、标记反应过程,标记反应的条件要是适合于标记物化学反应的,而于此同时又不能损伤FITC荧光标记抗体的活性。对于标记缓冲液中同样不能有游离基团或者抑制剂干扰反应;标记温度和时长也要合理控制;标记物与抗体的比例要合适,不是越多越好。整个标记反应过程要避光,所使用接触的所有的容器枪头一定要干净。
  
  四、标记反应完之后,残留的未标记的标记物、有机溶剂一定要去除干净(去除干净的标准同抗体溶液环境中游离干扰物去除方法),同时,PH要调整到FITC荧光标记抗体适合的环境。必要的时候加入30&左右甘油和保护性的蛋白,分装成小份-20℃保存。
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