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RNA的提取方法大总结


点击次数:642 发布时间:2019-09-30

RNA的提取方法大总结

 

这篇文章主要讲的是几种常用的RNA提取方法。

 

1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法

原理:使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性,经过起始密度为1.78g/ml的氯化铯介质,进行密度梯度超速离心,RNA沉淀于管底,而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法,不但能得到高质量的RNA,而且能同时分离出细胞染色体DNA.

本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞(如胰腺)的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高,已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长,一次提取的样品数量有限。

 

2、盐酸胍-有机溶剂法

本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的,适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶,匀浆裂解细胞,有机溶剂抽提去除蛋白质,通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA,提取的RNA质量较好,但整个操作过程繁杂费时。

 

3、氯化锂-尿素法

本法首先由Auffray报道,利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶,3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染,LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA,如5S RNA等。优点是快速简捷,尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取,其质量可以满足Northern分析,Oligo(dT)提取mRNA,SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10?g。

 

4、热酚法

本法主要用于少量细胞样品RNA提取,其产量不高,但简单易行。

 

5、快速提取法

本法主要用于培养细胞,通过0.5%SDS裂解细胞,酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀,快速纯化RNA。

 

6、细胞质RNA提取法

本法主要适用于培养细胞,首先去除细胞核,然后用蛋白酶K消化蛋白质,RNA提取酚抽提去除蛋白质。操作简单,同时能进行多个样品操作,多数步骤在室温下进行,提取的RNA质量较高,可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30~500?g/107个细胞。

 

7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA

本法是在Elion和Warner报道的方法基础上,有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞,变性,解聚蛋白,抑制RNase,并用EDTA保护DNA,后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度,而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析,DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。

 

8、一步快速热酚抽提法

基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法,美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒,使操作更为简单方便,并突出体现以下几个优点:1)将已知的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用,抑制了RNA的降解,增强了对核蛋白复合物的解离,使RNA与蛋白质分离进入溶液,提高了RNA的提取产量;2)RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相,容易被异丙醇沉淀浓缩,对大量或少量组织的细胞RNA提取,均甚合适;3)可在3小时以内处理大量样品,省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但会导致小RNA(<5.8S)的丢失,而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

 
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