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Western Blot内参抗体选择原则


点击次数:116 发布时间:2019-09-20

Western Blot内参抗体选择原则

 

内参抗体 种类很多,比如beta-actin、beta-tubunlin、GAPDH、α-tubunlin等,那么针对自己的实验,我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则:

 

一.样本种属来源:

 

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

1、哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K atp ase等。

2、植物来源实验样本,则可以选择plant actin、Rubisco等。

3、其他来源样本研究较少,所以就应该参照文献报导,选择合适的蛋白 作为内参。


 

二.目的蛋白分子量 :

 

选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子 量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD,此时不适宜选择β-actin作为内参,可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

 

三.目的蛋白表达 部位:

 

就一般的蛋白检测来说,β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等,在一些文献报道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。
 

以上几条原则只是针对通常情况,但是需要注意的问题是——内参的选择需要考虑实际的试验环境,比如某些细胞中,由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高,不适合做内参。比如在涉及细胞增殖相关试验中,c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参;而在凋亡实验时,TBP、Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献,在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常,应考虑这方面因素。

 
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